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技術(shù)文章

如何練就細(xì)胞計數(shù)神功?

更新時間:2022-06-09 瀏覽次數(shù):2316

01 細(xì)胞計數(shù)的重要性


對于大多數(shù)需使用細(xì)胞系的操作,如轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合技術(shù)、冷凍保存和傳代培養(yǎng)等,有必要在操作前對細(xì)胞數(shù)進行定量。因為如果接種細(xì)胞的密度過高,實驗還沒結(jié)束細(xì)胞就會出現(xiàn)接觸抑制,影響細(xì)胞狀態(tài),蛋白的表達也會受到影響;但如果密度過低最后收集到的樣品過少,檢測不到,我們要花額外的時間等待細(xì)胞長到合適的密度。

 

使用相同數(shù)量的細(xì)胞將保持最佳生長,并有助于使用細(xì)胞培養(yǎng)的程序標(biāo)準(zhǔn)化,這反過來也使結(jié)果具有更好的再現(xiàn)性。所以細(xì)胞計數(shù)非常重要,它是一個實驗成功的基礎(chǔ)。

 

文章開頭提到的血球計數(shù)板是以往細(xì)胞計數(shù)常用的方式,它的使用較為耗時,還易受操作者主觀判斷的影響,并且某些細(xì)胞類型,如形成簇的細(xì)胞類型,難以用這種方法計數(shù)。


 

0Scepter™3.0細(xì)胞計數(shù)儀 

 

現(xiàn)有的細(xì)胞計數(shù)設(shè)備可提供替代的細(xì)胞定量方法,這就包括我們的Scepter™3.0細(xì)胞計數(shù)儀。

 

Scepter™3.0細(xì)胞計數(shù)儀采用“計數(shù)金標(biāo)準(zhǔn)"庫爾特原理


  • Scepter感應(yīng)器吸入精確的樣本體積;

  • 細(xì)胞穿過感應(yīng)器小孔時,電阻值增加。電阻值的增加導(dǎo)致電壓的增加;

  • 每個細(xì)胞經(jīng)過時引起的電壓的增加作為一個脈沖被記錄下來;

  • 用直徑和細(xì)胞數(shù)目繪制直方圖,脈沖的大小代表細(xì)胞的大小,脈沖的數(shù)目代表細(xì)胞的個數(shù)。

最大的特點

  • 計數(shù)精準(zhǔn),提供基于細(xì)胞大小的直方圖(如上圖);

  • 手持式體積小巧;

  • 可以給出細(xì)胞體積;

  • 可以進行復(fù)雜的混合型的細(xì)胞計數(shù);

  • 計數(shù)迅速,平均在30秒之內(nèi)完成計數(shù)(最快14秒)。

 


0檢測范圍與應(yīng)用

 

基于細(xì)胞直徑以及樣品濃度的感應(yīng)器選擇指南:

樣本濃度范圍

(個/毫升)

50,000-1,500,000個/毫升

10,000-500,000個/毫升

直徑范圍(µm)

4-20 µm6-36 µm

適合測量的顆粒直徑范圍

5-158-25
感應(yīng)器規(guī)格40 µm60 µm

 

人體細(xì)胞中最小的是血小板,直徑只有約2微米;最大的是成熟的卵細(xì)胞,其直徑在200微米左右,鴕鳥卵細(xì)胞甚至可以達到長15~22厘米,直徑14至15厘米。細(xì)胞的直徑和大小會直接影響覆蓋度百分比,同樣的接種濃度,Cos7和293細(xì)胞最終的覆蓋度有著極大的區(qū)別。

讓我們來看看在分離PBMC后和流式直接對比的數(shù)據(jù):

外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是外周血中具有單個核的細(xì)胞,包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。外周血單個核細(xì)胞主要的分離方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度離心法。

 

離心獲得PBMC后分別染色通過流式進行分群(Lymphocyte 和Monocyte)和計數(shù),ScepterTM3.0的結(jié)果和流式在趨勢上具有很好的相關(guān)性。

無論是分群還是計數(shù)的回歸系數(shù)都達到了0.98以上。綜上所述,Scepter3.0可以準(zhǔn)確對PBMC細(xì)胞進行計數(shù)和分群。


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